Dimensionel elektroforese

FONT SIZE:
fontsize_dec
fontsize_inc
August 8, 2016 Nick Helle D 0 2

Elektroforesen todimensional gel, forkortet 2-D elektroforese, er en form for gelelektroforese er almindeligt anvendt til at analysere proteiner.

De proteinblandinger er adskilt af forskellige egenskaber i to dimensioner i disse 2D-geler. Teknikken blev først introduceret uafhængigt af O'Farrell og Klose i 1975.

Base adskillelse

Processen begynder med elektroforese i en dimension, men derefter adskiller molekyler i en retning på 90 grader fra den første. Elektroforese "1D" proteinerne separeret i en dimension, således at alle molekyler er langs en skinne. Fordi det er usandsynligt, at to molekyler er ens i to forskellige egenskaber, er de adskilt mere effektivt med elektroforese på 2-D elektroforese i 1-D.

De to dimensioner, hvor proteiner opnås ved denne teknik fordel egenskaber, såsom isoelektrisk punkt, massen af ​​komplekse proteiner og protein status.

Processen med at adskille proteiner ved isoelektrisk punkt kaldes isoelektrisk fokusering. I denne teknik, er en pH-gradient anvendes på en gel, og et elektrisk potentiale tilsættes gennem det, så at den ene ende er mere positiv end den anden. Hvis disse ender er positivt ladet, vil de være koblet til den negative ende af gelen og hvis de er negativt ladede vil blive placeret i den positive ende. Proteinerne, der anvendes i den første dimension bevæges langs gelen og vil akkumulere ved dets isoelektriske punkt; det vil sige, hvor den samlede ladning på proteinet er nul punktet.

Til analyse af, hvordan proteiner i en celle, viden om deres samarbejde er afgørende. Meget ofte proteiner handler sammen i komplekse at være fuldt funktionsdygtig. Analyse af denne sub organisering af cellen kræver bevaringsteknikker naturlige tilstand af proteinet kompleks.

I elektroforese på polyacrylamidgel, forbliver proteinerne i dets native tilstand og er adskilt i det elektriske felt i forhold til deres masse og massen af ​​deres komplekser hhv.

For en separation ved størrelse og ikke af nettoladning, som i IEF, et ekstra gebyr til proteiner den overføres ved hjælp af Coomassie Brilliant Blue eller lithium dodecyl sulfat. Efter afslutning af den første dimension, er komplekserne ødelægges ved anvendelse af denatureringsmiddel i den anden dimension, hvor komplekse proteiner adskilles ved deres masse. Forud for dette, er de behandlet med natriumdodecylsulfat sammen med andre reagenser. Dette denaturerer proteiner, dvs. indsat i lange, lige og molekyler og binder sig til en række molekyler med omtrent proportional med længden af ​​proteinet DSS.

Da SDS-molekyler er negativt ladede, er resultatet, at alle proteiner i det væsentlige har samme masse-til-ladningsforhold til hinanden. Hertil kommer, at de ikke migrerer, når ingen belastning, derfor belægningen af ​​proteinet i DSS giver mulighed for migration af proteiner i den anden dimension.

I den anden dimension, er et elektrisk potentiale påføres igen, men i en vinkel på 90 grader fra det første felt. Proteiner vil blive tiltrukket af den mere positive side af gelen DSSS fordi det er negativt ladet i forhold til deres masse-ladningsforhold. Som forklaret ovenfor vil dette forhold være omkring det samme for alle proteiner.

Migrationen af ​​proteinerne på den samme gel vil blive begrænset af friktionskræfterne. Derfor gelen virker som en molekylsigte når der påføres den nuværende betragtning adskillelse af proteiner baseret på deres molekylmasse. Således forbliver større proteiner højere i gelen og mindre proteiner er i stand til at passere gennem sigten og nå de nedre områder af gelen.

Proteinpåvisning

Resultatet er en gel med spredt ud over sine overfladeproteiner. Disse proteiner kan derefter detekteres ved hjælp af en række midler, selv indikatorreagenssammensætningen anvendes generelt sølv og Coomassie Brilliant Blue.

I det første tilfælde bliver en sølvkolloid påføres gelen, som binder til cystein grupper af proteinet, og sølv mørkere ved udsættelse for ultraviolet lys. Denne foranstaltning kan kun give omtrentlige mængder, men er tilstrækkelig til de fleste formål. Sølvfarvning er 100 gange mere følsom end den, der opnås med Coomassie Brilliant Blue til 40 gange større linearitetsområdet.

Andre end proteiner andre molekyler kan adskilles ved elektroforese på todimensional: i visse tests, DNA spiral adskilles i den første dimension og denatureres af en DNA-interkalator, såsom ethidiumbromid eller chloroquin er mindre kræftfremkaldende.

Analyse software til to-dimensionel gel

I kvantitative undersøgelser, der er værktøjer, der primært biomarkører analyseres ved kvantificering af individuelle proteiner, og viser adskillelsen af ​​et eller flere proteiner i et scannet billede af et todimensionalt gelbillede.

Disse værktøjer gør det også muligt at se punkter mellem geler af lignende prøver, for eksempel, kan detektere forskelle mellem proteiner i tidlige og fremskredne stadier af sygdommen.

Softwarepakker omfatter BioNumerics 2D, Delta2D, Image Master, Melanie, PDQuest, progenesis og Redfin, blandt andre.

Mens denne teknologi er meget udbredt, er det ikke blevet forbedret meget. For eksempel, mens PDQuest og progenesis tendens til at blive enige om kvantificering og analyse af pletter definerede og godt separerede proteiner giver forskellige resultater og tendenser analyse med mindre særskilte og definerede punkter.

Nogle af reparation funktioner baseret på automatisk analyse software omfatter:

  • Ufuldstændigt adskilt, mindre defineret og / eller separate pletter. eller.
  • Svagheder,.
  • Forskelle i gel bløder, som det tilfælde, hvor proteinet migrerer til forskellige positioner på forskellige geler.
  • Uopdagede steder.
  • Uoverensstemmende point.
  • Kvantiseringsfejl.
  • Forskelle i software algoritmer og derfor tendensanalyse.
  0   0
Forrige artikel Phalanta phalantha
Næste artikel Liber Iudiciorum

Kommentarer - 0

Ingen kommentar

Tilføj en kommentar

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tegn tilbage: 3000
captcha